·熟悉利用低温、干燥、缺氧等进行菌种保藏的原理。

 

·掌握菌种常用保藏技术。

 

二、任务原理

 

保藏菌种一般以试管的形式进行保存。菌种保藏的基本原理是尽可能地降低菌丝的生理代谢活动，使生命活动处于休眠状态，从而达到菌种保藏的目的。通常采用干燥、低温、冷冻及缺氧、真空等手段进行菌种保藏。

 

三、材料与仪器

 

母种试管、PDA试管斜面，麦粒、液状石蜡（装入三角瓶中，经高压蒸汽灭菌后，40℃干燥箱烘干水分后备用）、滤纸条（装入培养皿中经1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌后备用）、灭菌插菇铁丝架、无菌带棉塞空试管、超净化工作台、接种用具、无菌镊子、固体石蜡、坩埚、酒精灯、试管架、塑料薄膜、牛皮纸、捆扎绳、标签、普通冰箱等。

 

四、任务实施

 

1.斜面低温保藏法

 

将保藏的母种接入PDA斜面培养基中，待菌丝长至斜面的2/3时，选择菌丝生长粗壮整齐的母种试管，将试管口的棉塞用剪刀剪平。利用酒精灯在坩埚里溶化固体石蜡，用于密封试管口，在外包扎一层塑料薄膜，最后将试管斜面朝下放入4℃冰箱里保存。有效保藏期一般为3～6个月，最好在2～3个月时转管。如用无菌胶塞封口的菌种，在冰箱中可保藏3年之久，仍具有很强的生活力。保藏的菌种在使用时应提前12～24h从冰箱中取出，经过适温后恢复活力方能转管。

 

2.麦粒培养基保藏法

 

选择颗粒饱满、新鲜、无病虫害的小麦粒，用清水浸泡10h左右，滤干后分装入试管，容量为试管长度的1/3，塞好棉塞，在1.05kg/cm2压力下灭菌1h，28℃培养24h后，再在1.05kg/cm2压力下灭菌1h。在无菌操作下，将要保藏的菌种接入灭菌好的麦粒培养基内。在25℃下培养，菌丝长满培养基后，在无菌操作下换上无菌胶塞并蜡封，放入4℃左右冰箱内保藏。使用时，在无菌操作下，将每支斜面培养基中央接入少量麦粒，培养至菌丝长满斜面即可。采用麦粒培养基作为保藏菌种的培养基，可保藏菌种1年以上。

 

3.液状石蜡保藏法

 

将需要保存的菌种接到培养基上，最好用综合马铃薯琼脂培养基，在适温下培养至菌丝长满斜面。然后把液状石蜡装于三角瓶中，装至瓶体1/3处，塞上棉塞，并包纸，另将10mL试管若干支也包装好，在1.05kg/cm2压力下灭菌1h，再放入100℃烘箱内干燥1h，以蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接到空白斜面上，在28～30℃下培养2～3d，证明无杂菌生长方可使用。然后用无菌操作的方法把液状石蜡注入待保藏的斜面试管中。注入量以高出培养基斜面1～1.5cm，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处保藏。保藏时间在一年以上，在低温下，保藏时间还可延长。

 

五、实验报告

 

（1）结果分析　分析菌种保藏存活率低的原因。

 

（2）问题讨论　观察结果并对出现的问题进行分析、讨论。